1. 동결보존하고자 하는 세포는 약 80-90%의 밀도로 양호한 성장(대수기) 및 높은 생존율의 상태여야 한다.
2. 세포를 동결하기 전에 세포가 여전히 고유한 특성을 유지하는지 확인하십시오.
예를 들어, 하이브리도마는 냉동보존 1-2일 전에 항체 생산에 대해 테스트해야 합니다.
3. 동결방지제의 품질에 주의하십시오.
DMSO는 시약 등급의 멸균 및 무색이어야 하며(0.22 마이크론 FGLP Telflon으로 여과하거나 Sigma D-2650과 같은 직접 구입 멸균 제품으로 여과) 5-10 ml의 소량으로 분주하고 암실에서 4 oC에 보관해야 합니다. 여러 번 해동하지 마십시오. 글리세롤은 또한 시약 등급이어야 하며 고압멸균 후 암실에 보관해야 합니다. 장기간 보관하면 세포에 독성이 있으므로 개봉 후 1년 이내에 사용하십시오.
4. 동결보존을 위한 세포 농도:
(1) 정상 인간 섬유아세포: 1~3 x 106 cells/ml
(2) 하이브리도마: 1~3 x 106 cells/ml, 세포 농도가 너무 높아서는 안 되며 일부 하이브리도마는 높은 동결 농도로 인해 해동 24시간 후에 죽습니다.
(3) 부착성 종양주: 5~7 x 106, 세포 유형에 따라 다릅니다. 선암종은 해동 후 더 높은 농도가 필요하지만 HeLa는 1-3 x 106 cells/ml만 필요합니다.
(4) 기타 현탁액: 5~10 x 106 cells/ml, 인간 림프구는 최소 5 x 106 cells/ml이어야 합니다.
5. 동결 보호제 농도는 5% 또는 10% DMSO입니다. 세포의 동결 조건이 불확실한 경우 동결 실패를 방지하기 위해 동결 보존하는 동안 백업 배양을 사용해야 합니다.
6. 냉동 방법:
(1) 전통적인 방법: 4 oC 10분 ---> -20 oC 30분 ---> -80 oC 16-18시간(또는 밤새) ---> 액체 질소 탱크의 증기상에서 장기 보관 .
(2) 프로그램 냉각 : 등속 냉각기를 사용하여 상온에서 -1 ~ -3 oC/min의 속도로 -120 oC까지 낮추고 액체 질소 탱크의 증기 상태로 장기간 보관 기간 저장. 현탁 세포 및 하이브리도마의 보존에 적합합니다.
7. 재료:
(1) 잘 자라는 배양세포
(2) 신선한 배지
(3) DMSO(시그마 D-2650)
(4) 멸균 플라스틱 동결보존관(Nalgene 5000-0020)
(5) 0.4% w/v 트립판 블루(GibcoBRL 15250-061)
(6) 혈구판 및 커버 유리
(7) 등속 냉각기(KRYO 10 Series II)
8. 단계:
(1) 동결 하루 전에 배지의 절반 또는 전체를 교환하고 세포 성장을 관찰하십시오.
(2) 냉동보존용액의 조제(사용전 조제) : 새로운 배지에 DMSO를 첨가하고 최종농도가 5~10%가 되도록 잘 섞은 후 실온에 두어 나중에 사용한다.
(3) 세포 계대배양의 조작에 따라 배양된 세포를 채취하고 소량의 세포 현탁액(약 0.1 ml)을 취하여 세포 농도 및 동결 전 생존율을 계산한다.
(4) 원심분리하여 상층액을 제거하고 적절한 양의 냉동보존액을 첨가하여 세포농도가 1-5 x 106 cells/ml가 되도록 하고 잘 섞어 표지된 냉동보존관 1 ml/vial에 분주하고 소량을 취한다. 오염 감지를 위한 세포 현탁액의 양.
(5) 냉동보존법 1 : 냉동관을 4℃에 10분 방치 → -20℃에서 30분 → -80℃에서 16~18시간(또는 밤새) → 액체질소 탱크 증기상 장기보존
(6) 냉동 보관 방법 2 : 냉동 튜브를 프로그램이 설정된 등속 냉각기에 넣은 다음 액체 질소 탱크에 넣습니다.
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